Report MST

Introduzione

Si è utilizzata una linea cellulare di fibroblasti NIH3T3 per preparare 3 piastre: MST 1,MST 2,MST 3.
Con due verranno allestite 12 piastre che saranno utilizzate per delineare una curva di crescita e per effettuare il mantenimento cellulare nel corso degli incontri di laboratorio (MST 2, MST 3). Una terza (MST 1) verrà congelata per 5 giorni per testare la sopravvivenza cellulare.

Mantenimento linea cellulare

NIH0001 20x - Immagine di cellule confluenti 100%.

Abbiamo seguito il protocollo per il mantenimento della linea cellulare. Dalla sospensione cellulare abbiamo effettuato una conta individuando   123,5 x 10^4 cell/ml.
Abbiamo quindi allestito 3 piastre (1,2,3) per procedere nei giorni successivi all'allestimento di una curva di crescita e al congelamento di una piastra.
La piastra 1 è stata utilizzata per il congelamento mentre a partire dalle piastre 2 e 3 abbiamo ottenuto 4 piastre (dalla 4 alla 7).
Nei giorni successivi abbiamo scelto tra le piastre preparate quella che presentava caratteristiche migliori per proseguire con il mantenimento e l'allestimento della curva di crescita.
Abbiamo quindi selezionato la piastra 5.

NIH0004 10X -Immagine piastra 5 cellule confluenti al 100%.

Tramite l'utilizzo della camera di Burker abbiamo contato un totale di 58,25*10^4 cell/ml e quindi, seguendo il protocollo, e sapendo che si volevano avere 200000 cellule finali è stata allestita la piastra 13 per il mantenimento della linea cellulare (a partire dalla stessa piastra 5 sono state allestite anche le 12 piastre per la curva di crescita).

Congelamento linea cellulare

Per procedere con il congelamento abbiamo utilizzato la piastra 1 :

NIH0010 10 x - Immagine di cellule confluenti al 100 % prima del congelamento

Abbiamo seguito il protocollo per il mantenimento della linea cellulare per preparare una cryovials da congelare per 5 giorni a -80°C.
Per un errore dell'operatore è stata aspirata dalla piastra la tripsina con le cellule in sospensione, quindi si è proceduto con il reinserimento di 2 ml di tripsina per staccare le cellule rimaste adese.
Al termine dei cinque giorni abbiamo preso il cryovial dall'incubatore e ne abbiamo prelevato il contenuto per testare la sopravvivenza cellulare.
Per errore è stato aspirato insieme al surnatante anche parte del pellet cellulare ma è stato comunque possibile procedere con il saggio di sopravvivenza cellulare.

Nei giorni successivi si è quindi passato alla conta delle cellule vive (bianche) e morte (blu) tramite la camera di Burker ottenendo i seguenti risultati:

> Cellule Morte : 9,5*10^4 cellule/ml  quindi 19*10^4 cellule totali

> Cellule Vive : 94,75*10^4 cellule/ml  quindi 189,5*10^4 cellule totali

Tramite l'applicazione di una semplice proporzione che teneva conto del numero di cellule totali (vive e morte) abbiamo calcolato la percentuale di cellule vive, 91% e morte, 9%.

Marcatura con Sytox Green e Phalloidin

Tramite l'utilizzo di Polilisina è stato possibile permettere l'adesione delle cellula sul vetrino e nei giorni successivi tramite l'utilizzo del PAF sono state fissate.
In seguito abbiamo aggiunto i coloranti Sytox Green e Phalloidin e dopo tre giorni di incubazione abbiamo ottenuto i seguenti risultati:

Con Phalloidin si è messo in evidenza l'actina:

  NIH0022 40X

 Con Sytox green si sono colorati i nuclei:

 NIH0036 40X

Allestimento curva di crescita

Abbiamo utilizzato le piastre 2 e 3 allestite il primo giorno, da queste si sono preparate 4 piastre, MST4 MST5 MST6 MST7.
Nei giorni successivi a partire dalla piastra 5 ( contenente 58,25*10^4 cell/ml) abbiamo allestito, seguendo il protocollo e mantenendo un totale di 350000 cellule per piastra, 14 piastre di cui 12 sono state utilizzate i giorni successivi per allestire la seguente curva di crescita.

CURVA DI CRESCITA:

Asse delle X: giorni di conta cellulare

Asse delle Y: Numero cellule