Report SV

Introduzione

All'inizio del laboratorio di colture cellulari, ci è stata data una piastra contenente cellule NIH3T3 (fibroblasti immortalizzati) sulle quali abbiamo lavorato facendo:
- il mantenimento della linea
- il congelamento con successivo scongelamento e saggio di sopravvivenza
- la messa a punto di una curva di crescita
- la colorazione di due vetrini con syntox-green (rende visibili i nuclei evidenziando il DNA) e falloidina (colora l'actina, quindi il citoscheletro delle cellule)

Per ogni esperimento sono di seguito riportati i risultati con relativo commento.
Le informazioni riguardanti le procedure e i dati grezzi sono invece rintracciabili all'interno del quaderno di laboratorio.

Mantenimento

Il mantenimento di una linea cellulare è un passaggio fondamentale per qualsiasi esperimento si voglia allestire con le colture, in quanto permette di avere sempre a disposizione le cellule di interesse.

Il vantaggio di questa procedura rispetto al congelamento, per conservare le cellule, consiste nel fatto che non si rischia di danneggiare il campione e di avere un aliquota minore di cellule vive allo scongelamento. D'altra parte, però, la linea può subire delle mutazioni che potrebbero influire sul risultato dell'esperimento, mentre le cellule scongelate mantengono il corredo genetico identico a quello del momento del congelamento anche a distanza di anni. Quindi di solito si mandano avanti in parallelo le due procedure per combinarne i vantaggi.

Descrizione esperienza

A partire dal primo giorno abbiamo effettuato, dunque, il mantenimento tutte le volte, controllando ad ogni incontro (a parte un'eccezione per dimenticanza) la confluenza della piastra di partenza. Per quanto riguarda il nostro gruppo, abbiamo sempre osservato una confluenza tra l'80 e il 100% e le cellule stavano sempre bene.

La procedura consiste, a grandi linee, nel diluire la piastra di partenza contando le cellule e decidendo di conseguenza quale volume di risospensione prelevare per ripiastrarne un numero definito, tale che sia possibile la loro crescita in incubatore. Infatti questo passaggio è solitamente effettuato al raggiungimento della confluenza, momento in cui le cellule non possono più crescere.

Abbiamo documentato il mantenimento con delle foto, riportate di seguito. La prima immagine si riferisce alla piastra ricevuta il primo giorno, probabilmente appartenente ad un gruppo del turno di Marzo.

foto piastra ricevuta all'inizio del laboratorio (obiettivo 20X):


foto piastra tripsinizzata (obiettivo 20X):


foto camera di Burker per la conta cellulare (obiettivo 10X):


foto piastra dell'ultimo mantenimento (NIH3T3 SV 18/04/11 Linea) (obiettivo 10X):

Congelamento / scongelamento / saggio di sopravvivenza

Il congelamento, come citato nel capitolo relativo al mantenimento, serve per conservare le cellule a distanza di lungo tempo: è una procedura che permette dunque di riutilizzare la stessa linea anche dopo tanti anni, nonstante abbia il difetto di non garantire il 100% della sopravvivenza al momento dello scongelamento del campione. Per questo si può fare un saggio di sopravvivenza quando si recupera il vial, in modo tale da avere un'idea della percentuale di cellule ancora vive.

Descrizione esperienza

Per quanto riguarda la nostra esperienza, abbiamo congelato le cellule il giorno 06 Aprile, mettendole in un "cryovial" a - 80°C. Per impedire danni dovuti ad un congelamento troppo rapido, i campioni sono stati posti in contenitori di polistirolo pieni di ovatta. Inoltre, per evitare che l'espansione dell'acqua trasformata in ghiaccio rigonfiasse eccessivamente le cellule, nella soluzione è stato aggiunto DMSO (DiMetilSolfOssido).
Solitamente, dopo alcuni giorni, il campione andrebbe spostato in azoto liquido a -180°C per la conservazione ottimale, tuttavia nel nostro caso non è stato possibile perché i contenitori erano pieni e comunque abbiamo scongelato le cellule il giorno 11 Aprile.


Lo scongelamento è stato effettuato nel bagnetto a 37°C. In seguito abbiamo piastrato il campione e l'abbiamo lasciato crescere in incubatore fino al 13 Aprile, quando l'abbiamo usato per allestire la colorazione con Blu Tripano necessaria per il saggio di sopravvivenza. Va ricordato che, per non perdere le cellule morte non adese alla piastra, quanto andrebbe aspirato si raccoglie nel falcon usato per la centrifugazione: così il pellet risultante conterrà la totalità del campione di partenza. Per quanto riguarda il nostro gruppo, abbiamo ottenuto l' 85,6% di cellule vive per mL di campione attraverso la conta. Questo è stato possibile perché il colorante entra nelle cellule morte tingendole di blu, mentre le cellule vive, tendenzialmente, non subiscono modificazioni cromatiche e sono quindi distinguibili.



NB: per motivi tecnici a noi sconosciuti, non abbiamo più trovato nella chiavetta le foto che avevamo fatto alla piastra scongelata e fatta crescere e alla camera di Burker contenente le cellule colorate con blu tripano. Esserndo che le foto delle giornate successive sono state salvate correttamente sulla stessa chiavetta, questa non poteva tuttavia essere piena.

Curva di crescita

La curva di crescita, come dice il nome stesso, è utile per monitorare l'andamento della crescita di una popolazione cellulare. Si parte da un campione che si semina omogeneamente in più piastre numerate, si mette il tutto in incubatore e ad intervalli regolari si contano le cellule di una, due o tre piastre per conoscere la dimensione della popolazione in quel dato momento.
Le altre, invece, sono lasciate crescere fino all'utilizzo. Dopo ogni conta, i campioni usati si eliminano perchè non vengono mantenuti. Normalmente, per avere una curva più rappresentativa possibile, sarebbe opportuno prelevare più gocce dalla stessa risospensione.

Descrizione esperienza

Nel nostro caso, siamo partiti da una risospensione di un pellet di fibroblasti NIH3T3 e abbiamo seminato 12 piastre contenenti ciascuna 25.000 cellule.
Ad ogni incontro, abbiamo contato due gocce provenienti da altrettante piastre e fatto la media delle cellule totali per ottenere i punti della curva mostrata in grafico.

foto piastra 2 (11/04/11) (obiettivo 20X):


foto piastra 5 (15/04/11) (obiettivo 10X):

Abbiamo preso due foto della stessa piastra perché abbiamo trovato due campi a densità cellulare diversa.

foto piastra 8 (18/04/11) (obiettivo 10X):



Dati:

piastre	cellule totali medie in 3mL di risospensione	deviazione standard
12 piastre di partenza (08/04/11)	2,5 *10^4	0
piastre 1-2 (11/04/11)	26,625 *10^4	2,474874
piastre 3-4 (13/04/11)	68,625 *10^4	6,770472
piastre 5-6 (15/04/11)	70,875 *10^4	6,52331
piastre 7-8 (18/04/11)	97,800 *10^4	10.18932
piastre 9-10 (20/04/11)	87,375 *10^4	4,086126

Grafico della curva di crescita completa di deviazione standard.

Grafico della curva di crescita completa di deviazione standard e di linea di tendenza con una funzione polinomiale di quarto grado.

La funzione polinomiale di quarto grado è risultata la curva che approssimava meglio la distribuzione dei nostri dati: per trovarla, abbiamo fatto la prova con diverse equazioni.

Colorazione vetrini

La colorazione di vetrini ottenuti dalla fissazione di cellule provenienti da una piastra di coltura permette di visualizzare componenti del citoplasma o del nucleo, ma non mantiene in vita il campione, quindi non può essere utilizzata per indagare fenomeni quali la migrazione cellulare, la crescita o altri.
Tale metodica può essere eseguita mediante l'uso di coloranti fluorescenti, come la falloidina o il syntox-green che evidenziano rispettivamente l'actina (quindi il citoscheletro) e il DNA (di conseguenza il nucleo).

Descrizione esperienza

Due campioni della nostra linea sono stati fissati e colorati rispettivamente con falloidina e syntox-green per visualizzare il citoscheletro e i nuclei delle cellule NIH3T3.
Le cellule sono state inzialmente fissate sui vetrini grazie alla polilisina (favorisce l'adesione cellulare) e alla PAF (paraformaldeide, fissativo), per poi subire le due colorazioni.
Infine abbiamo osservato al microscopio rovesciato a contrasto di fase a fluorescenza i risultati, riportati di seguito.

Foto marcatura con falloidina (obiettivo 40X):


La marcatura con falloidina è risultata molto lieve, quindi abbiamo dovuto isolare uno dei pochi campi abbastanza fluorescenti, abbiamo effettuato un'esposizione molto lunga (6 secondi) e migliorato il contrasto con il software GIMP2.

Foto marcatura con syntox-green (obiettivo 40X):


La marcatura con syntox-green è venuta molto megliore e non ha richiesto accorgimenti di alcun tipo, oltre a necessitare un'esposizione di 1 solo secondo.

Foto particolari

Foto mantenimento giorno 18/04/11 (obiettivo 20X):


le cellule evidenziate potrebbero essere in mitosi perché sono tonde, quindi non adese, e vicine una all'altra.

Foto piastra 8 curva di crescita giorno 18/04/11 (obiettivo 10X):


Le cellule presentano vacuoli all'interno: questo potrebbe significare che non stanno benissimo e si spiega col fatto che stanno crescendo da 10 giorni nella stessa piastra.

Foto colorazione con syntox-green (obiettivo 40X):


In quest'immagine, possiamo osservare delle cellule con nuclei più piccoli e più rifrangenti delle altre: questo può essere considerato indice di morte cellulare, in quanto la cromatina risulta essere molto addensata.

Link utili

Informazioni generali sulle colture cellulari

Protocollo generico (fornito per questo laboratorio. Per informazioni più dettagliate consultare il quaderno di laboratorio)

Informazioni linea cellulare NIH 3T3 (in fondo alla pagina c'è il link al sito dell'ATCC)

reagenti particolari:
- Falloidina
- Syntox-Green
- Blu Tripano
- DMSO
- Polilisina
- Paraformaldeide (PAF)

Esempio curva