Report AIA

MANTENIMENTO

Piastra madre con fibroblasti NIH3T3. Piastra confluente (superficie occupata al 97%) Ingrandimento 10x

Dopo avere tolto il mezzo di coltura e aver fatto un lavaggio con PBS viene aggiunta la tripsina:

Le cellule appaiono tondeggianti e mobili poichè non sono più adese. Ingrandimento 10x

Alla piastra viene poi aggiunto il mezzo di coltura e dopo aver trasferito il tutto in una provetta Falcon, si centrifuga. Il pellet viene risospeso nel mezzo di coltura e la sospensione viene infine prelevata per allestire nuove piastre.

CONGELAMENTO E SCONGELAMENTO

Il congelamento serve per conservare a lungo le cellule in modo tale che si possano manipolare in un tempo successivo.

Congelamento

Piastra destinata al congelamento. Ingrandimento 10x

Dopo aver effettuato il mantenimento, viene trasferita un' aliquota della sospensione in una criovial e viene aggiunto DMSO che serve ad evitare la formazione di cristalli.
La criovial viene trasferita in un deep freezer (-80°C) ma per consentire un congelamento graduale essa è inserita in un contenitore con ovatta che funge da isolante.

Scongelamento

La criovial viene messa nel bagnetto termostatico (37°C).
Il suo contenuto è prelevato e trasferito in una Falcon assieme al terreno di coltura; dopo centrifuga e risospensione è quindi possibile allestire una nuova piastra.

Ingrandimento 10x

SAGGIO DI VITALITA'

Per il saggio di vitalità è stata utilizzata la piastra dello scongelamento.
Le cellule sono state messe in una Falcon assieme al mezzo di coltura e al PBS, e dopo la centrifuga è stato aggiunto Tripan Blue (che colora le cellule morte).
Una goccia della sospensione è stata messa nella camera di Burker e si è visto che c'erano in media 147*10^4 cellule vive/mL (83,88%) e 28,25*10^4 cellule morte/mL.

Marcatura

Nella piastra contentente due vetrini viene messa la Polylisina per favorire l'adesione delle cellule ai vetrini stessi. Dopo un'incubazione di 30 min, la polylisina viene aspirata e si fanno due lavaggi con acqua.
Alla piastra dei vetrini viene aggiunto terreno di coltura e le cellule della linea che sono state precedentemente mantenute.
Si mette poi in incubazione la piastra a 37°C.

Fissazione

Dalla piastra dei vetrini viene tolto il terreno e viene effettutato un lavaggio con PBS; è poi aggiunta la paraformaldeide (PAF) che, dopo 20 min di incubazione, viene tolta.
( La paraformaldeide è un fissativo ).
Dopo un ulteriore lavaggio con PBS si mette la piastra in frigorifero.

Colorazione

I vetrini vengono prelevati dalla piastra e appoggiati su due vetrini portaoggetti ricoperti di Parafilm. Si incubano i vetrini con PBS Triton (0,3%) per 15 min in modo da rendere le membrane delle cellule più permeabili.
Una volta tolto PBS Triton viene aggiunto un colorante diverso a ciascun vetrino:
-ad uno il Sytox Green, che si lascia incubare 10 min al buio e serve per colorare i nuclei delle cellule;
-all'altro la Falloidina che si lascia incubare per 20 min al buio e serve per colorare l'actina (e quindi tutta la cellula).
Il Sytox Green e la Falloidina dopo l'incubazione vengono tolti e si fanno due lavaggi con PBS. I vetrini vengono spostati su due vetrini portaoggetti sui quali è stato precedentemente aggiunto il montante. I vetrini vengono rigirati affinchè le cellule si fissino tra vetrino e vetrinoportaoggetto.
Il tutto viene messo ad asciugare per un paio d'ore e poi conservato in frigo.

Osservazione della fluorescenza

Osservando i vetrini al microscopio a contrasto di fase a fluorescenza si ottengono le seguenti immagini:

Il Sytox Green colora il DNA e di conseguenza evidenzia i nuclei delle cellule. Ingrandimento 40x

La Falloidina colora i filamenti di actina. Ingrandimento 40x

CURVA DI CRESCITA

Per fare la curva di crescita abbiamo allestito 12 piastre, contenenti ciascuna 25.000 cellule.
Per la preparazione di queste piastre sono state utilizzate le cellule di una delle piastre allestite nel giorno 6 Aprile.
Abbiamo fatto la conta cellulare di questa piastra (= 82,25*10^4 cell/ml )e poi abbiamo calcolato quanti ml prelevare da quella sospensione cellulare per arrivare ad avere 14 piastre ( due in più per eventuali errori) con 25.000 cellule.
14*25.000=350.000
82,25*10^4:1=350.000:x
x=0,42 ml
In una Falcon abbiamo messo 0,42 ml di sospensione e 13,58 ml di terreno per arrivare ad un volume totale di 14 ml e poi abbiamo pipettato 1ml di questa sospensione in ognuna delle 12 piastre, dove erano già presenti 2 ml di terreno.
Le 12 piastre sono state osservate( 2 alla volta) nei giorni 11/04, 13/04, 15/04, 18/04, 20/04.
Ogni giorno di ciascuna delle 2 piastre è stato fatto il mantenimento e si è arrivati ad avere una Falcon per ogni piastra con un volume totale di 3 ml (2ml di mezzo+ 1ml di tripsina).
Infine è stata fatta la conta cellulare delle varie sospensioni ottenendo le cellule/ml, che noi abbiamo opportunatamente moltiplicato per 3 per avere il numero totale di cellule.
La seguente curva è stata costruita facendo la media tra il numero totale di cellule delle due piastre contate ogni giorno.

Asse x: giorni di osservazione della crescita
Asse y: numero delle cellule totali

Dal giorno 11/04 al 15/04 si nota un'accrescimento esponenziale del numero di cellule. Dal giorno 15/04 al 18/04 si ha invece una brusca diminuzione del numero di cellule che potrebbe essere dovuto: -al fatto che non è stato aggiunto nuovo mezzo di coltura e quindi i nutrienti potrebbero essere quasi del tutto esauriti -al fenomeno di inibizione da contatto Dal giorno 18/04 al 21/04 la diminuzione risulta più lieve.

La nostra curva risulta abbastanza conforme alle curve teoriche per questo tipo di esperienza di laboratorio, quindi possiamo ipotizzare che nel nostro lavoro non siano stati fatti errori rilevanti.

Deviazione standard

I dati sono relativi alle conte cellulari di ogni quadrato della camera di Burker delle varie piastre utilizzate per costruire la curva di crescita. In seguito abbiamo calcolato la media e la deviazione standard.

Nel grafico che segue compare la curva di crescita con le deviazioni standard: