programma

Programma di laboratorio

• mantenimento della linea
• congelamento
  
• allestimento dell’esperimeto per la curva di crescità
• scongelamento
• marcatura fluorescente dell’actina con falloidina
• conta cellulare
• acquisizione di immagini:
• a contrasto di fase
• time-lapse
• analisi marcatura actina in fluorescenza

INDICAZIONI GENERALI

PRIMA DI INIZIARE A LAVORARE SOTTO CAPPA:

• Utilizzare il materiale monouso (provette e pipette) in modo accurato evitando sprechi inutili.
• Indossare i guanti al momento di manipolare in sterilità.
• Eliminare le pipette e soltanto le pipette nella pattumiera dedicata.
• Aspirare ed eliminare tutto il contenuto delle provette prima di eliminarle.
  

DURANTE IL LAVORO SOTTO CAPPA:

• Identificare tutte le piastre di coltura con:
• sigla specifica del gruppo
• nome linea cellulare
• data
  
• scrivere piccolo sulla circonferenza della piastra (non in centro)

NON mettere in incubatore delle piastre bagnate esternamente.

A LAVORO TERMINATO

• Pulire l’emocitometro (o camera di Bürker) con acqua, asciugare e deporre nella scatola
• Deporre mezzo di coltura, PBS e tripsina nel frigorifero
• Lasciare il laboratorio in ordine
• Inoltre a fine giornata
• Pulire la cappa prima con acqua e soltanto dopo con alcool
• Spegnere
• la cappa
• il pipettatore
• la pompa
• il bagno maria
• i microscopi e il computer
• mettere nell’armadio i sacchetti con provette, pipette e piastre

Documentare

Documentazione manuale:

il quaderno di compila in laboratorio il quaderno deve contenere tutte le informazioni che documentano il lavoro sperimentale il quaderno riporta sia i dati grezzi che le analisi il quaderno riporta eventuali errori o modifiche rispetto a quanto previsto

Documentazione digitale:

acquisizione d'immagine a contrasto di fase acquisizione di filmati in time lapse a contrasto di fase acquisizione d'immagine a fluorescenza semplice acquisizione d'immagine a fluorescenza doppia

Protocollo generico

Current opinion in cell biology generic protocol (pdf)

Emocitometro

Modalità di uso dell'emocitometro (pdf)

cell staining

Trypan Blue Staining: Viability Cell Count

Materials:

• Suspension culture of cells
• Sterile transfer pipettes Stock 0.2% (w/v)
• Trypan blue
• Hemacytometer and microscope

Protocol:

1. Gently swirl a suspension culture to distribute the cells evenly. Aseptically remove a small sample (0.1 mL) of cells from the cultures. Place the sample in a separate test tube (it need not be sterile).
   
2. Dilute 4 parts of stock Trypan Blue with 1 part of 5X saline and add 0.1 mL of the diluted dye to your sample. Mix gently.
   
3. Set up a hemocytometer and cover slip. Immediately place a drop of the stain/culture combination on the hemocytometer (remember to use both sides of the hemocytometer) and wait one minute.
   
4. Observe the cells with low power microscopy. Count the total number of cells, and the number of stained cells.
   
5. Compute the concentration of viable cells per mL of culture.

Notes: Trypan Blue is a stain that is actively extruded from viable cells, but which readily enters and stains dead cells. Therefore, the cells which are blue are dead. The difference between the total number of cells and the number of dead cells would be the number of viable cells in a given aliquot of your culture.

Marcatura con Sytox green

The SYTOX green dye is impermeant to live cells and apoptotic cells, but stains necrotic cells with intense green fluorescence by binding to cellular nucleic acids.

SYTOX Green nucleic acid stain (S7020) is particularly useful for cell-cycle analysis on RNase-treated fixed cells

Protocollo di marcatura:

• lavare le cellule con PBS
  
• fissare le cellule in PAF 4% per 20' (questa fase del protocollo deve essere eseguita sotto cappa chimica)
• lavare le cellule con PBS
  
• incubare le cellule con PBS-Triton 0.3% per 15'
  
• incubare con Sytox Green diluito 1:30.000 in PBS per 10'-15'
  
• lavare tre volte con PBS
• montare
  

Marcatura con Phalloidin

• lavare le cellule con PBS
• fissare le cellule in PAF 4% per 20' (questa fase del protocollo deve essere eseguita sotto cappa chimica)
• lavare le cellule con PBS
  
• incubare le cellule con PBS-Triton 0.3% per 15'
  
• incubare le cellule con Rhodamine-phalloidin (R415) diluita 1:20 in PBS per 20'
  
• lavare tre volte con PBS

*** Phalloidin binding requires the F-actin to have a protein structure near native. Methanol or acetone used to fix and / or permeabilize essentially abolishes phalloidin binding. ****

1° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocolli per:
• passaggio della una linea cellulare di fibroblasti NIH3T3
• conteggio delle cellule
  
  
• chiedere e organizzare il materiale occorrente
  
  
• svolgere l’esperimento:
  
• passare la linea cellulare e preparare 3 piastre di colture da 6 cm di diametro per il mantenimento della linea e per il congelamento. Ciascuna piastra deve contenere 250.000 cellule.


• Documentare
  

2° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocollo per:
• congelamento della linea cellulare
  

• chiedere e organizzare il materiale occorrente
  
  
• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea e in previsione dell'allestimento della curva di crescita
• congelare le cellule di una delle piastre
  
  
• Documentare
  

3° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocolli per:
• allestimenti delle piastre per le curva di crescità

• chiedere e organizzare il materiale occorrente
  
  
• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• allestire le piastre (25.000 cellule ca.) per la curva di crescita
  
  
• Documentare

4° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocolli per:
• scongelamento della linea cellulare
  

• organizzare il materiale occorrente
  
  
• svolgere l’esperimento:
  
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• conta cellulare per curva di crescita
• scongelare le cellule
  
  
• Documentare
  

5° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocolli per:
• saggio di sopravvivenza con colorazione con blue tripano
• colorazione con sytox green
  
  
• chiedere e organizzare il materiale occorrente
  
  
• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• conta per curva di crescita
  
• fissare le cellule per marcatura con sytox green e phalloidina
  
  
• Documentare

6° incontro

PARTE PRATICA

• preparare protocolli per:
• saggio di sopravvivenza con colorazione con blue tripano
• colorazione con falloidina e con syntox green
  
  
• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• conta per curva di crescita
• marcatura con falloidina e syntox green
  
  
• Documentare

7° incontro

PARTE PRATICA

• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• conta per curva di crescita
• osservazione marcature Sytox Green e Phalloidin
  
  
• Documentare

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Valutazione individuale del lavoro di laboratorio (1° parte)

8° incontro

PARTE PRATICA

• svolgere l’esperimento:
• passare la linea cellulare per mantenimento della linea
• conta per curva di crescita
  
  
• Documentare: quaderno di laboratorio e acquisizioni immagini

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Valutazione individuale del lavoro di laboratorio (2° parte)

9° incontro

Consegna Report

	--->	Consegna online del report con documentazione, elaborazione ed interpretazione dei risultati

Valutazione preparazione teorica