Mutagenesi diretta da oligonucleotide con selezione di un filamento fosforotioato

Per migliorare l'efficienza delle mutagenesi sono state sviluppate delle tecniche per selezonare il filamento mutato rispetto a quallo wt.

Uno di questi metodi prevede:

- allungamento del primer mutageno da perte della DNA polimerasi in presenza di 3 desossinucleotidi normali (dATP, dTTP, dGTP) ed uno fosfotioato (dCTPaS), il filamento di nuova sintesi conterrà quindi il nucleotide fosfotioato in corrispondenza di ogni C.

- digestione con l'enzima di restrizione PstI (che non taglia i filamenti fosfotioati) che produce un taglio solo del filamento Wt, ma non in quello mutato.

- rimozione del filamento inciso mediante trattamento con esonucleasi III che degrada il DNA a partire dalle estremità.

Il DNA risultante è trasformato in E.coli. Il che porterà ad un amumento nel numero di DNA corcolari mutati.

Mutagenesi con Fosforo-tioati

• Si basa sul fatto che alcuni enzimi di restrizione (ad es. AvaI, AvaII,
BanII, HindII, NciI, PstI e PvuI) non tagliano DNA contenente
fosforotioati

• L’oligonucleotide mutante si associa al DNA bersaglio come di
consueto ma per l’estensione dell’oligo si usano nucleotidi precursori
particolari, cioè dei fosforo-tioati.

• Così si creano DNA “heteroduplex” con un filamento (il mutante)
fosforo-tioato e un filamento (wild type) con fosfati normali. I single
strand non completamente allungati/sintetizzati dall’innesco
dell’oligonucleotide si eliminano con la esonuclesi del fago T5.

• L’heteroduplex si tratta con un enzima (nell’esempio NciI) che in
corrispondenza del sito di taglio fa solo un nick sul filamento
PARENTALE non essendo capace di agire sul filamento con i
fosforotioati

• Il filamento parentale contenente il nick viene degradato con una
esonucleasi (eso III) e risintetizzato in vitro in modo da ottenere un
dsDNA con entrambi i filamenti mutagenizzati.

• Infine si trasforma il DNA mutato in E.coli