Task N.7: site-directed mutagenesis


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mutagenesi con metodo USE

Mutagenesi USO

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Elimina il sito di restrizione unico

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Usa due primers: il primo viene detto primer mutagenico, in quanto è il responsabile dell'introduzione della mutazione, il secndo elimina il sito unico nel plasmide

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Heteroduplex: lo stampo ha il sito di restrizione, mentre il filamento nuovo ha la mutazione, ma non il sito di restrizione

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Incubazione con enzima. Si ottiene la linearizzazione della catena leggera, ma non dell'heteroduplex

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Trasformazione in ceppo di E. Coli Che non effettua la riparazione (BMH71-18 DNA muts lineare trasforma 10-1000 volte di più rispetto al circolare) si ottiene la replicazione dell'heteroduplex

  • MsoNormal" style="margin: 0cm 0cm 0pt; mso-margin-top-alt: auto; mso-margin-bottom-alt: auto; mso-list: l0 level1 lfo1; tab-stops: list 36.0pt">Seconda digestione e trasformazione nel ceppo di E. Coli normale (mutati 5-50%)