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Metodo Kunkel The Kunkel method for site-directed mutagenesis is a classic method for introducing mutations (either single base pairs or larger insertions, deletions, or substitutions) into a DNA sequence. There are three main steps to performing Kunkel mutagenesis. Tale metodo utilizza uno stampo a singolo filamento di DNA per la reazione di mutagenesi, ma ottenuto da un ceppo di E. coli dut – ung - . ll gene dut codifica per una UTPasi che degrada il dUTP all’interno della cellula. La mutazione di dut determina quindi un aumento di dUTP nella cellula che è incorporato al posto della T nel DNA. In genere l’Uracile non viene incorporato nel DNA, e se ciò dovesse accadere c’è un enzima, l’Uracile-N-Glicosilasi (Ung), in grado di riconoscerlo ed eliminarlo. ma in questo caso essendo maggiore la concentrazione di dUTP rispetto a quella di dTTP si favorisce l'incorporazione di Uracile all'interno del DNA al posto della T. Si isola l’ssDNA che avrà uno singolo strand contenente le U al posto delle T. A questo punto si fa avvenire l'annealing tra l'oligonucleotide contenente la mutazione, fosforilato in 5', e il plasmide a singolo filamento che avrà lo strand interno con le U al posto delle T nel gene X wild-type, quello esterno (fatto in vitro) con tutte le A nel gene X con la mutazione (mismatch). Si trasferisce poi il tutto in un ceppo di E.coli normale, il suo sistema di riparazione riconosce le U e degrada quel filamento. Ne deriva che si replicherà solamente lo strand esterno contenente la mutazione, e, una volta che andrò a piastrare su ampicillina, i cloni che si ottengono sono quelli contenenti il gene mutato.