Task N.7: site-directed mutagenesis


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Dnp1

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Modified: 7 October 2009, 12:42 AM   User: Tontodonati Giulia  → 

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This technique (detta anche Quickchange) is based on the use of the restriction enzyme dpn1 which è specifico per il DNA metilato di origine batterica.

This figure illustrate the mutation A--->T in the sequence TAC.
The principle steps of this method are:
  1. Denaturazione dei due filamenti di DNA del plasmide da mutare
  2. Riappaiamento con due oligonucleotidi mutagenici complementari (ciascuno dei quali contenente la mutazione desiderata nella stessa posizione) che faranno da primers per la successiva PCR
  3. PCR con la polimerasi Pfu ad alta fedeltà per ottenere due nuove molecole di DNA contenenti la mutazione, che si appaieranno per dare il plasmide mutato.
  4. Digestione con l'enzima di restrizione DpnI in modo da degradare il DNA parentale ma da lasciare intatto quello neosintetizzato, che non è metilato.
  5. Il plasmide mutagenizzato viene infine trasformato in cellule batteriche.

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 mutagnenesis 01