Task N.7: site-directed mutagenesis
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Mutagenesi diretta da oligonucleotide con selezione di un filamento fosforotioato
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Modified: 19 October 2009, 5:18 PM User: Mana Giulia →
Per migliorare l'efficienza delle mutagenesi sono state sviluppate delle tecniche per selezonare il filamento mutato rispetto a quallo wt.
Uno di questi metodi prevede:
- allungamento del primer mutageno da perte della DNA polimerasi in presenza di 3 desossinucleotidi normali (dATP, dTTP, dGTP) ed uno fosfotioato (dCTPaS), il filamento di nuova sintesi conterrà quindi il nucleotide fosfotioato in corrispondenza di ogni C.
- digestione con l'enzima di restrizione PstI (che non taglia i filamenti fosfotioati) che produce un taglio solo del filamento Wt, ma non in quello mutato.
- rimozione del filamento inciso mediante trattamento con esonucleasi III che degrada il DNA a partire dalle estremità.
Il DNA risultante è trasformato in E.coli. Il che porterà ad un amumento nel numero di DNA corcolari mutati.