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Con la mutagenesi a cassetta è possibile inserire una breve sequenza di DNA, contenente la mutazione desiderata, al posto della corrispondente regione wild-type presente nel gene bersaglio.

La tecnica richiede che il frammento di DNA in cui inserire la mutazione sia clonato in un plasmide e fiancheggiato da due siti di restrizione.

Fasi:

1. Taglio del plasmide: avviene usando due enzimi di restrizione diversi in modo da dare il corretto orientamento al filamento inserito.
2. Separazione del frammento e sostituzione con una CASSETTA OLIGONUCLEOTIDICA a doppio filamento che contenga la mutazione da introdurre.
3. Ligazione
   

Vantaggi:

• sistema semplice
• efficienza vicina al 100%
• possibilità di ottenere mutanti multipli. Eccellente per lo screening di peptidi mutanti.

Svantaggio:

• necessità di siti unici di restrizione ai lati della regione da mutagenizzare. Inoltre vi è un numero troppo alto di combinazioni mutanti che si possono generare, a seconda della lunghezza della cassetta che rendono impraticabile l'analisi di tutti i cloni.